題目：泛癌分析揭示乳酸代謝在免疫治療反應預測和生存預測新的見解

英文名：Pan-cancer analysis implicates novel insights of lactate metabolism into immunotherapy response prediction and survival prognostication

雜志：Journal of Experimental & Clinical Cancer Research

影響因子：11.4

研究背景：免疫療法已經成為一種有效的臨床癌癥治療方法，靶向腫瘤細胞中的乳酸代謝（LM）作為增強抗腫瘤免疫反應的方法是一種有前景的治療策略。作者利用scRNA-seq數據和多種機器學習（ML）算法，在泛癌水平上揭示了LM和免疫治療耐藥性之間的緊密相關性，并進一步建立了一種新的LM相關特征基因集（LM. SIG），為患者選擇合適的免疫治療提供了參考。

研究思路：

圖1

作者首先在兩個免疫療法scRNA-seq數據集中說明并驗證了LM與免疫治療反應之間是存在負相關的。隨后，基于40個泛癌scRNA-seq隊列建立了LM相關特征基因集（LM.SIG），然后，基于8個免疫治療轉錄組隊列和30個癌癥基因組圖譜（TCGA）泛癌數據集，采用15種機器學習（ML）算法來驗證LM.SIG在免疫治療反應預測和生存預測方面的能力。此外，作者還基于17個CRISPR數據集，篩選了免疫治療潛在的靶點，通過下游實驗在胰腺癌類器官中進行了驗證。

研究結果：

1、 LM上調與免疫治療耐藥相關

作者對2個免疫治療的scRNA-seq數據集進行分析，計算LM的相關基因的得分，結果表明，LM水平升高的惡性細胞在無應答（NR）組內表現出富集（圖2A），這個結果在另一個數據集得到驗證（圖2C-D），這些結果共同表明LM與免疫治療耐藥有關。

圖2

2、 使用泛癌scRNA-seq隊列建立LM. SIG

作者利用泛癌scRNA-seq隊列數據，進行GSVA分析，篩選與LM相關基因的基因集：LMx（與LM呈正相關的基因）、LMy（惡性細胞中上調的基因），取交集得到LMn。計算LM1-LM40的單個基因的Spearman相關系數（R）的幾何平均值，超過0.25的基因收集到LM SIG中，共有84個基因（圖2E）。基于Reactome（圖2F）、GO（圖2G）和KEGG（圖2H）對這84個基因注釋，結果表明，LM. SIG主要富含乳酸代謝相關和致瘤途徑，如煙酰胺腺嘌呤二核苷酸（NADH）相關途徑、三羧酸（TCA）循環相關途徑和TP53調節，有幾個基因被報道與免疫活性相關，如C1QBP、TUFM、LDHA、LDHB和ACAT1。

3、基于泛癌TCGA隊列的LM. SIG免疫圖譜

在基因層面，作者比較了LM.SIG與不同癌癥類型免疫相關基因表達水平之間的相關性，LM.SIG評分與這些基因的表達之間存在顯著負相關（圖3A）。細胞層面，高LM.SIG評分的腫瘤減少了抗腫瘤免疫細胞的浸潤，包括NK細胞和細胞毒性淋巴細胞（圖3B）。在通路上，高LM. SIG評分的患者中排名靠前的通路有氧化磷酸化、活性氧途徑、DNA修復和MYC靶向通路等（圖3C）。因此，獲得較低LM.SIG的患者往往比獲得較高LM.SIG的患者獲得更好的抗腫瘤免疫。

圖3

4、LM.SIG的免疫治療反應預測

將8個臨床信息完整的免疫治療數據集，分類為訓練集（n=618）、驗證集（n=154）和測試集（n=79）（圖4A）。使用7種機器學習算法訓練模型，并迭代10次重復5倍交叉驗證，計算AUC值，確定best的LM.SIG模型（圖4B-C）。隨后進行了一系列測試，證明了LM.SIG在預測泛癌數據集中免疫治療反應的能力。

圖4

5、LM.SIG 的生存預測

為了調整LM.SIG對泛癌生存率的預測，作者開發了一種基于SurvBenchmark設計的生存模型。評估了各種生存特異性模型，利用TCGA泛癌患者數據集訓練LM.SIG預后模型，MTLR_GA并被確定為best模型（圖5A）。

圖5

6、使用CRISPR研究從LM. SIG產生的潛在治療靶點

從7項CRISPR研究中提取17個CRISPR數據集，CRISPR基因中z評分排名靠前的基因被視為免疫抵抗基因（圖6A）。LM.SIG占排名靠前的基因的比例高于其他特征（圖6B-C）。為了進一步研究具有免疫治療預測和生存預測的靶點，將19個CRISPR集中的基因和10個LM. SIG預后模型相關的基因取交集，得到靶點基因LDHA（圖6D）。LDHA基因的顯著性也在TCGA泛癌數據集和3個隊列數據集中得到驗證（圖6E-G）。

圖 6

7、LDHA缺乏增強胰腺癌的抗腫瘤免疫和免疫治療反應

從患者外周血中分離CD8+T細胞和CD14+單核巨噬細胞，體外M-CSF激活并與sh-NC 或 sh-LDHA胰腺癌類器官共培養（圖7A）。顯微鏡觀察和細胞活力檢測顯示，LDHA的敲除顯著地減慢了類器官的生長速度（圖7B）。通過IHC染色，在sh-LDHA 類器官中也觀察到Ki-67的低表達（圖7C）。同時，分析共培養系統中的CD8+T細胞和巨噬細胞。RT-qPCR結果顯示，共培養時，T細胞殺傷基因和免疫檢查點基因（IFNG、GZMB、PDCD1和CTLA4）的表達顯著升高，而巨噬細胞M2相關標志物（CD206、CD163、TGFB和ARG1）的表達降低，M1相關標志物（IL1A、IL1B和CD80）的表達增加（圖7D）。這些結果表明sh-LDHA 的類器官中巨噬細胞從原瘤轉向抗腫瘤。此外，流式細胞術分析顯示sh-LDHA組的CD8+T細胞具有更強的抗腫瘤活性和增殖能力（圖7E-G），巨噬細胞更傾向于抗腫瘤M1極化（圖7H-K）。用KPC細胞（sh-NC和sh-LDHA）注射到小鼠的腹部外側產生皮下腫瘤，并在第9、12和15天腹腔注射抗IgG或抗PD1（圖7L）。與sh-NC組相比，sh-LDHA組抗PD1治療效果更顯著，腫瘤減少更明顯（圖7M，N）。IHC結果還表明，sh-LDHA的腫瘤具有豐富的免疫細胞浸潤和較慢的腫瘤增殖（圖7O）。實驗結果表明，LDHA影響免疫細胞的狀態，低表達的LDHA提高了它們在胰腺癌免疫治療中的療效。

圖 7

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