題目：單細胞分析揭示了乳腺癌亞型形成過程中的模擬進化

英文名：Single-cell analyses reveal evolution mimicry during the specification of breast cancer subtype

雜志：Theranostics

影響因子：12.4

發表時間：2024年05月19日

研究背景：干細胞或祖細胞的前身通過遺傳和表觀遺傳程序賦予癌細胞發育的可塑性和獨特的細胞特性。目前還沒有利用新技術對乳腺癌的起源細胞進行全面鑒定和繪圖，以揭示新的亞型特異性治療靶點。

研究思路：通過公共數據庫整合了來自正常乳腺組織的195,144個高質量細胞和來自原發性乳腺癌樣本的406,501個高質量細胞，創建了人類正常乳腺和癌癥乳腺的大規模單細胞圖譜。通過將癌細胞與參考正常上皮細胞進行對比，探索了惡性細胞的潛在異質性來源。通過多組學分析以及體外和體內實驗，篩選并驗證了潛在的亞型特異性治療靶點。在的隊列中，通過免疫組化驗證了已確定的免疫和基質細胞亞群的新型生物標記物。基于癌細胞起源模式的腫瘤分層與臨床結果、基因組畸變和不同的微環境構成相關。發現管腔祖細胞（LP）亞型與預后不良、基因組不穩定和免疫微環境失調密切相關。然而，LP亞型患者對新輔助化療（NAC）、PARP抑制劑（PARPi）和免疫療法敏感。通過體外和體內實驗研究了LP亞型特異性靶點PLK1。此外，乳腺癌的大規模單細胞圖譜分析啟發識別了一系列與臨床相關的免疫和基質細胞亞群，包括先天性淋巴細胞（ILCs）、巨噬細胞和內皮細胞亞群。

研究結果：

1、人類正常乳房和癌變乳房的大規模綜合細胞圖譜

為了生成全面的單細胞轉錄信息，從公開數據集（圖1A）中收集并分析了35個正常乳腺組織和181個原發性乳腺癌樣本的scRNA-seq數據，并繪制了正常乳腺組織和癌變乳腺組織的轉錄圖譜。經過質量控制和數據預處理后，共有195,144個來自正常乳腺組織的高質量細胞和406,501個來自原發性乳腺癌樣本的高質量細胞被納入的分析（圖1A）。為了確定正常乳腺組織細胞成分的特征，在校正了不同數據集的批次效應后，對所有細胞進行了基于圖的無監督聚類（圖1B）。所有主要細胞類型，包括三個上皮亞群（BM、LP和ML）、免疫細胞、內皮細胞、成纖維細胞和周細胞，都根據標準細胞標記進行了注釋，并通過UMAP進行了可視化（圖1B-C）。在腫瘤區室中，除了上皮細胞、內皮細胞、成纖維細胞和周細胞外，還發現了豐富的免疫亞群，包括T細胞、B細胞、漿細胞和髓系細胞，它們具有獨特的細胞特征（圖1D-E）。

圖1

2、乳腺癌細胞與正常乳腺上皮細胞亞型的配準

上述分析表明，正常乳房有三個上皮細胞大群，即BM、LP和ML亞群，并根據不同基因特征的表達確定了七個次要亞群（圖2A）。根據癌細胞起源模式和內部異質性，整個腫瘤細胞被分為20個亞群，并通過UMAP進行可視化（圖2C）。利用ROGUE分析觀察到LP組的癌細胞在三大亞組中表現出highest的異質性（圖2D）。為了了解這些腫瘤細胞群的基因組變化，使用inferCNV算法估算了單細胞拷貝數變異（CNVs），結果顯示LP組的惡性腫瘤細胞表現出明顯的高CNV水平（圖2E）。此外，為了確定這些亞群的生物學特性，按照之前的描述確定了癌細胞的復發狀態（圖2F）。此外，還利用標志基因組研究了這些亞群的功能異質性。雌激素反應相關基因的表達在ML亞型中富集（圖2G）。總之，根據癌細胞起源模式確定了乳腺癌細胞的三種分子亞型，并對每種分子亞型中的癌細胞狀態和功能異質性進行了細致的表征。

圖2

3、LP亞型乳腺癌的分子和臨床特征

為了確定已確定的癌細胞起源模式的臨床相關性，首先在METABRIC隊列中進行了去卷積分析，去卷積樣本呈現出顯著的瘤內異質性（圖3A）。LP亞型與不良預后明顯相關，且與年齡、腫瘤分級、腫瘤大小、腫瘤分期、腫瘤突變負荷（TMB）和細胞周期評分無關（圖3B）。鑒于LP衍生癌細胞的CNV負擔較高，進一步探討了TCGA數據集中LP為主的惡性腫瘤與基因組改變特征之間的關系。與單細胞分析推斷出的CNV負擔增加相一致，LP亞型的腫瘤顯示出較高的TMB水平，尤其是以下腫瘤COSMIC突變特征SBS3（與同源重組缺陷（HRD）有關）和SBS13，而非SBS2（均與APOBEC基因突變有關）介導的脫氨（圖3C）與HRD相關的復雜基因組改變事件（HRD評分）在LP評分較高（LP-高）的乳腺腫瘤中也顯著升高（圖3D）。值得注意的是，LP高患者對NAC和PARPi治療敏感（圖3E-F）。綜上所述，這些研究結果表明，LP亞型乳腺癌具有較高的TMB和基因組不穩定性，但對NAC和PARPi治療敏感。接下來探討了臨床隊列中LP亞型乳腺癌的功能和免疫特征。基因組富集分析（GSEA）顯示，LP亞型的轉錄特征富集于γ干擾素反應、炎癥反應、細胞因子-細胞因子受體相互作用和先天性免疫系統通路（圖3G）。然而，LP高的腫瘤表現出T細胞衰竭特征評分和各種免疫抑制檢查點表達水平的升高（圖3H）。此外，還發現，在I-SPY2隊列中，LP亞型患者更有可能在ICB聯合NAC治療后獲得pCR（圖3I）。為了確定PSAT1狀態與臨床進展之間是否存在關系，對乳腺癌組織芯片進行了IHC染色。結果顯示，PSAT1染色主要呈細胞質狀（圖3J），PSAT1過表達表明無病生存期（DFS）較差。利用這些生物標記物，的IHC隊列將LP分子亞型定義為PSAT1高/ER低/CK14低（圖3J），LP組顯示預后較差（圖3K）。綜上所述，發現了LP亞型乳腺癌具有明顯的低預后、特殊的分子和臨床特征，并進一步篩選和驗證了候選標志物，為臨床實踐提供了依據。

圖3

4、確定LP亞型乳腺癌的潛在治療靶點

考慮到染色體畸變是乳腺癌LP亞型的顯著特征，接下來致力于探索染色體不穩定性的主要相關因素，并將其作為LP亞型的潛在治療靶點，這涉及到不同的全局組學領域。結合本研究中通過整合單細胞和大容量RNA-seq分析得出的假定參與者，以及最近通過基因組規模的Perturb-seq調查發現的基因，成功地闡明了包括PLK1、TPX2、CDK1和AURKA在內的260個候選基因群（圖4A-B）。此外，還利用GSVA技術計算了一系列乳腺癌細胞系的LP特征得分。精心鑒定出SUM-149PT是典型的LP亞型乳腺癌細胞系，而MCF-7。則是典型的非LP乳腺癌對照細胞系（圖4C）。為了篩選出參與LP亞型乳腺癌染色體不穩定的主要因素，初步發現，抑制PLK1、TPX2、CDK1和AURKA對腫瘤細胞的增殖產生了不同的影響，這一點可以從所觀察到的漸變中看出（圖4D）。選擇PLK1作為闡明LP亞型復雜性的關鍵因素。觀察到，抑制PLK1大大增強了SUM-149PT細胞的凋亡過程，而對MCF-7細胞的凋亡沒有明顯影響（圖4E）。細胞遺傳學調查顯示，SUM-149PT細胞在經歷PLK1損傷后，染色體畸變的頻率增加，包括染色體截斷和斷裂等現象（圖4F）。而在受到類似PLK1抑制的MCF-7細胞中卻沒有發現這種現象（圖4F）。此外，還在小鼠模型中評估了PLK1對腫瘤生長的影響。值得注意的是，與對照載體細胞相比，發現抑制了PLK1的SUM-149PT細胞的腫瘤擴張速度減慢了（圖4G-I）。值得注意的是，在volasertib處理下，SUM-149PT細胞（而非MCF-7細胞）的細胞增殖受到明顯抑制，同時凋亡誘導也顯著增強（圖4J-K）。在SUM-149PT小鼠模型中，觀察到服用volasertib后腫瘤生長也有類似的減弱（圖4L-N）。綜上所述，這些結果表明PLK1有可能是LP亞型乳腺癌中染色體不穩定性的一個基本因素，因此成為LP亞型乳腺癌領域中一個值得探索的治療靶點。

圖4

5、淋巴細胞、自然殺傷細胞(NK)和先天淋巴細胞(ILC)的綜合分析

鑒于不同分子亞型乳腺癌的免疫微環境各不相同，接下來的目標是通過整合scRNA-seq技術和生物信息學方法，構建高分辨率的乳腺癌免疫細胞圖譜。首先，整合了156289個T細胞和NK/ILCs，確定了24個集群，其中包括7個CD4+T集群、8個CD8+T集群、6個循環T集群和3個NK/ILCs集群（圖5a）。然后，根據標記基因的表達和功能特征對這些集群進行了注釋（圖5B）。所有主要細胞類型都有代表，并且在不同的分子亞型中表現出不同的比例（圖5C）。為了探索這些集群的生物學特征，對不同亞群的幼稚型、細胞毒性型、衰竭型和調節型T細胞特征進行了初步評分（圖5D）。為了深入了解NK/ILC的組成，重建了NK/ILC的聚類，并確定了三個主要亞群，包括兩個NK細胞群和一個新的ILC3細胞群（圖5E）。FGFBP2+NK細胞顯著表達細胞毒性和效應標志物，如FGFBP2、FCGR3A和PRF1，并顯示出細胞溶解和吞噬途徑的富集（圖5F-G）。最后，研究了這種新型IL7R+ILC3集群的預后價值，發現IL7R+ILC3集群的高組成與較長的無復發生存期（RFS）密切相關（圖5H），這表明這種新型ILC3集群可作為乳腺癌的一種可靠的預后生物標志物。

圖5

6、乳腺癌中的髓樣細胞異質性

為了進一步確定乳腺腫瘤微環境（TME）中髓樣細胞的異質性，分析了52,955個髓樣細胞的scRNA-seq數據，并基于無監督圖譜將其聚類為19個基于典型細胞標記的次要亞群（圖6A-B）。主要細胞系包括肥大細胞、樹突狀細胞（DC）、單核細胞、巨噬細胞和循環髓系細胞（圖6A）。肥大細胞的特點是特異性高表達TPSAB1、TPSB2和KIT，在ML亞型樣本中含量豐富（圖6B-C）。根據經典細胞標記物的表達，DCs被分為多種亞型，包括傳統的1型和2型DCs（cDC1s、cDC2s）、遷移性DCs（mDCs）、類漿。細胞DCs（pDCs）和非典型DCs（nc-DCs）（圖6AB和圖S9A-B）。CD1A+cDC2集群rare地存在于ML亞型樣本中，并特異性表達朗格漢斯細胞標志物，如CD1A和CD207（朗格林），這表明該集群代表朗格林+DCs（圖6C）。隨后，巨噬細胞形成了七個亞群，它們具有不同程度的"經典活化"M1樣和"替代活化"M2樣巨噬細胞特征得分（圖6D）。據報道，在這些巨噬細胞亞群中，SPP1+TAM和C1QC+TAM這兩個TAM亞群表現出TAM的二分功能表型（圖6D）。此外，還發現了一個C1QC+CLEC10A+TAM亞群，它可能是類DCTAMs，具有HLA基因（HLADQA2和HLA-DQB1）、CLEC10A和CD1E的過表達。以及比經典DC更高的TAM特征得分（圖6B、D）。值得注意的是，ML亞型樣本中富集的新型巨噬細胞亞群的特點是肌酸激酶腦同工酶（CKB）表達升高（圖6C-E）。CKB是肌酸激酶家族的成員，可在ATP和肌酸之間可逆地轉移高能磷酸基團，生成磷酸肌酸和ADP。使用GSVA進行的通路富集分析表明，氧化磷酸化和細胞外基質（ECM）受體相互作用在CKB+巨噬細胞亞群中富集（圖6F）。

在METABRIC隊列中，較高的CKB+巨噬細胞組成和較高的CKB表達均與生存劣勢有關，IHC結果進一步驗證了CKB+細胞的增加表明DFS較差（圖6G-H）。在接受ICB治療的患者中，CKB+巨噬細胞的組成與免疫治療耐藥性和不良預后呈正相關（圖6I）。總之，這些數據說明了乳腺癌中腫瘤浸潤髓系細胞的情況，并表明所發現的新型CKB+巨噬細胞亞群可能對預測乳腺癌的預后和免疫治療反應具有重要價值。

圖6

7、正常乳房和癌變乳房的基質區由不同類型的細胞組成

為了研究包括EC、成纖維細胞和周細胞（也稱為類血管周細胞（PVL））在內的基質區的異質性，整合了正常乳房和癌癥乳房的基質細胞，并校正了批次效應。首先，分析了33,529個（18,096個來自乳腺癌，15,433個來自正常乳房）內皮細胞，并鑒定了不同血管床（動脈、毛細血管和靜脈）的不同淋巴管和血管（圖7A）。根據保守標記注釋了正常乳房和癌變乳房中的四個主要內皮分區（圖7B）。令人驚訝的是，正常乳房和癌變乳房的內皮細胞未能均勻地混合在一起，顯示出它們之間明顯的生物學差異。在正常乳腺和癌變乳腺的同源內皮細胞中觀察到了一系列不同表達的標記物。例如，PDPN和CCL21在正常乳腺和惡性乳腺的淋巴細。胞中均有過表達（圖7B）。此外，AKR1C1只在正常乳腺組織的淋巴細胞中被發現，而LYVE1則在惡性腫瘤的淋巴細胞中明顯表達（圖7B）。為了進一步闡明乳腺癌中EC的異質性，首先進行了ROGUE分析。結果表明，在四個EC亞群中，毛細血管EC的異質性highest，然后，毛細血管細胞被進一步重新聚類為五個亞群（圖7C）。此外，CA4+毛細血管內皮細胞明顯表達與脂肪酸和甘油的攝取和代謝有關的標記物，包括FABP4、FABP5和CD36（圖7D）。還確定了一種血管生成基因（PGF）表達較高的血管生成毛細血管EC（圖7D）。觀察到這些毛細血管內皮細胞亞型的比例存在差異，在ML亞型樣本中發現CA4+毛細血管內皮細胞的比例明顯下降（圖7E）。在METABRIC隊列中，CA4+毛細血管EC特征與優越的存活率相關（圖7F）。此外，還進行了IHC分析，以確定患者生存率與CA4+毛細血管EC豐度之間的關系。在的隊列中觀察到類似的結果（圖7G-H）。相比之下，血管生成毛細血管細胞豐度較高的患者生存期明顯較短。此外，對血管生成抑制劑曲班尼（trebananib）敏感的患者表現出血管生成毛細血管細胞特征評分升高（圖7I）。此外，還發現，對ICB治療敏感的膀胱癌患者血管生成毛細血管EC的組成減少，且與不良預后相關（圖7J-K）。總之，這些分析建立了EC的細胞圖譜，可能有助于闡明乳腺癌中EC亞群的異質性、功能和臨床意義。

圖7

總結：本文利用scRNA-seq和Bulk RNA-seq數據分析，分析結果實驗驗證，研究揭示了乳腺癌的細胞譜系和起源細胞模式。傲星生物有豐富的分析方案、完善的下游驗證、機制研究服務，一對一專屬服務為您排憂解難，助您輕松應對畢業和晉升！