題目：通過代謝組學分析、網絡藥理學和分子動力學模擬鑒定紫蘇葉中對抗高尿酸血癥的抑制劑

英文名：Identification of inhibitors from a functional food-based plant Perillae Folium against hyperuricemia via metabolomics profiling, network pharmacology and all-atom molecular dynamics simulations

雜志：frontiers in Endocrinology

影響因子：3.9

發表時間：2024年2月16日

研究背景：高尿酸血癥（HUA）是一種由嘌呤代謝功能障礙引起的代謝紊亂，其中嘌呤水平升高可部分歸因于海鮮消費。紫蘇葉（PF）歷來被用于緩解海鮮引起的疾病。然而，其對HUA的療效和潛在機制仍不清楚。

研究思路：進行網絡藥理學分析以確定PF治療HUA所涉及的候選靶點和潛在機制。通過基因本體論（GO）和京都基因與基因組百科全書（KEGG）分析預測潛在機制。在AutoDockVina和PyRx中進行分子對接，以預測草藥化合物與HUA相關靶點之間的結合親和力。通過分子動力學（MD）模擬、文本挖掘和非靶向代謝組學分析進一步驗證了這些抑制劑在HUA中的作用。

圖1

研究結果：

1、紫蘇葉治療高尿酸血癥的草藥化合物及潛在靶點

通過網絡藥理學分析，并得到了18個靶點，包括黃嘌呤脫氫酶(XDH)、基質金屬蛋白酶-3(MMP3)、單胺氧化酶A型(MAOA)、線粒體醛脫氫酶(ALDH2)、絲裂原活化蛋白激酶8(MAPK8)、Caspase-凋亡酶(Caspase-凋亡酶)8(CASP8)、過氧化物酶體增殖激活受體γ(PPARG)、轉錄因子p65(RELA)、趨化因子（C-X-C矩陣）配體8(CXCL8)、腫瘤壞死因子(TNF)、轉錄信號轉導和激活因子3(STAT3)、前列腺素G/H合成酶2（PTGS2）、腎素（REN）、雌激素（ESR1）、白蛋白（ALB）、5-羥色胺受體2A（HTR2A）、血管內皮生長因子A（VEGFA）和白細胞介素6（IL6）（圖2A）。根據STRING數據庫中的25個候選靶點構建了一個PPI網絡（圖2B）。如圖2B所示，這些靶標被分為紅色、綠色和藍色三組。該網絡的25個節點之間有102條邊，每個節點至少與一個其他節點相關聯。

圖2

2、紫蘇葉參與多種信號傳導途徑

為闡明化合物-靶標相互作用的可能機制，進行了GO和KEGG富集分析，在15個通路中，癌癥通路的基因比例maximum（圖2C）。在GO分析中，通過BP、CC和MF分析對25個潛在靶標進行了注釋，并根據p值將相應的術語從小到大排序（圖2D）。根據CC分析（圖2D），細胞外區域部分、細胞頂端部分、細胞外區域、質膜區域、膜筏、膜微域、頂端質膜、膜區域、質膜部分、基底側和質膜被確定為前十大類別。

3、評估與高尿酸血癥蛋白對接的紫蘇葉化合物

為了根據相應的分子結構探索PF化合物是否與HUA的潛在靶點存在生物學聯系，328種成分與25種HUA靶點進行了對接蛋白質，產生了8200個對接結果，結合得分最好的前10個靶點是ZH01（XDH）、ZH02（MMP3）、ZH24（ABCC1）、ZH03（MAOA）、ZH15（ALB）、ZH23（SLC22A8）、ZH22（SLC22A6）、ZH16（HTR2A）、ZH12（PTGS2）、和ZH05（MAPK8）。其中，XDH的平均結合能minimum（-6.76kcal/mol），表明XDH與328個PF化合物結合良好。在直方圖中，根據平均結合親和力對25個目標物進行了排序，并將其分為四組（圖3）。具體來說，(I)組對應的是排名前一至四位的靶標，而其余21個靶標則平均分為三組，即(II)組、(III)組和(IV)組。如圖3所示，至少有一種配體與（I）組至（III）組的靶標具有高親和力（結合分數≤-9kcal/mol），有20多種配體對ZH01（only的一種）具有類似的作用。此外，大多數化合物（超過50%）與(I)組和(II)組目標物的對接親和力為間歇性（-9至-6kcal/mol）。相反，大多數化合物與（III）類和（IV）類靶標的結合親和力較弱（>-6kcal/mol），特別是ZH09和ZH17，它們的結合配體數都約為300（91.4%）。

圖3

4、化合物-靶標網絡揭示了潛在的多靶標多活性化合物機制

根據化合物的結合能，選出了每個靶標的前10個活性化合物。剔除重復的化合物后，共保留了32個活性化合物來構建網絡（圖4）。在32個活性化合物中，有24個與一個以上的靶點表現出良好的結合能力。有10種化合物與25個靶點中一半以上的靶點結合良好。值得注意的是，ZS059和ZS058的度值均為21。上述發現可能凸顯了PF對HUA的協同作用，其特點是多靶點和多組分機制。

圖4

5、根據328種化合物的結構及其親和力進行聚類分析至XDH

隨后對328種PF化合物進行了基于結構的分析。如圖5a所示，大多數PF化合物與這兩種抑制劑的相似性較弱。在圖5B中，328種化合物根據其相應的結合能以不同顏色顯示為節點。值得注意的是，maximum聚類中的節點往往呈紫紅色，這表明它們通常具有良好的結合親和力（圖5B）。

圖5

6、五種與XDH有強烈相互作用的配體具有類似于藥物的性質，并且非有毒分子

為了進一步探索哪些成分更有可能成為HUA的潛在抑制劑，考慮了一些參數，包括泛檢測干擾化合物（PAINS）、氫鍵（H-bonds）、結合親和力和ADMET特性。經過篩選，確定了5個合格化合物，包括ZS025、ZS056、ZS090、ZS093和ZS252。如圖6所示，ZS090與XDH形成了一種而ZS025、ZS056和ZS093則在同一區域形成了兩個H鍵。除了在兩個活性位點殘基（Gln1195和Arg913）上形成H鍵外，ZS252還通過不利的供體-供體鍵與Ser1081相互作用，距離分別為2.25a、2.85a和1.14?。

圖6

7、分子動力學模擬五種潛在抑制劑

如圖7所示，利用結構和動力學量（包括RMSD、RMSF、Rg、SASA和氫鍵數量）分析了六個模擬系統的構象穩定性和靈活性。如圖7A所示，蛋白質-配體復合物在系統弛豫后約10ns達到平衡，這一點從曲線在此時間后形成高原可以看出。這表明ZS025具有更高的穩定性、與XDH活性位點上的其他配體相比，它在很大程度上保留了其初始結構（圖7B）。對于Rg和SASA，用Rg測得的蛋白質構象隨時間的變化見圖7C，用SASA測得的變化見圖7D。如圖7E和F所示，RMSF和RMSF計算的變化主要集中在Thr750至Val1333之間的結合位點殘基上。大部分峰值都位于環狀區域周圍，并且相互高度重疊。此外，波谷也呈現出類似的趨勢，尤其是配體結合型結構。

圖7

8、根據文獻挖掘和非靶向代謝組學研究，證明黃芩苷是一種潛在的XDH抑制劑

為了找到這五種化合物在體外和體內對尿酸產生生物效應的實驗室證據，在PubMed、Scopus和CINAHL的基礎上進行了文本挖掘分析。搜索的記錄來自最早的可用記錄至2023年6月28日。查詢框中添加的關鍵詞包括黃芩苷、芐基alpha-mannopyranoside、鄰苯二甲酸二異丁酯、欖香素、鄰苯二甲酸二異丁酯、(3R)-羥基-beta-酮、高尿酸血癥、尿酸、黃嘌呤氧化酶和黃嘌呤脫氫酶。考慮了所有可用的關于這五種潛在化合物的英文體內和體外實驗研究。剔除重復結果后，剩下10條記錄可供進一步分析。四篇已發表的文章中都報道了黃芩苷。這些論文的結果主要基于體外研究，所進行的研究主要是黃嘌呤氧化酶抑制活性測定。然而，除黃芩苷外，其余四種化合物在作者的鑒定研究中未見報道。此外，作者還比較了這五種抑制劑與非布索坦的結構，結果顯示ZS025的相似度highest，為0.50877，呈淺黃色。這一發現也與上述結果（圖5a）一致。基于上述發現，進一步研究中重點關注了ZS025。隨后，為了證實ZS025存在PF顆粒的混合物中，使用UPLC-ESI-Q-Orbitrap-MS進行了非靶向代謝組學分析。在質譜結果中發現了543個分子。在這543個分子中，有22個與從中醫藥信息平臺數據庫中檢索到的分子相吻合，如迷迭香酸、黃芩苷、魚腥草素、木犀草素7-O-beta-D-葡萄糖苷和木犀草素。

圖8

9、黃芩苷-XDH復合物200ns的分子動力學模擬

圖9A-F描述了時間序列分析結果比較了apoXDH蛋白和黃芩苷結合的XDH蛋白。黃芩素在大約20ns的平衡后保持了相似的RMSD、Rg和SASA值，平均值分別為0.213nm、3.21nm和489.2?2。這些結果與apo-XDH蛋白的結果差別不大：RMSD為0.218nm，Rg為3.22nm，SASA為489.5?2。從圖9A-C中的RMSD、Rg和SASA值可以看出，與沒有配體的情況相比，在這個較長的模擬過程中，與黃芩素結合的蛋白質折疊更緊湊、更穩定。此外，隨著模擬時間的延長，氫鍵頻率的增加也反映了進一步緊密結合的可能性。最初，平均1-2個氫鍵可穩定黃芩素的結合。大約75ns后，氫鍵增加到3-4個，如圖9E中的高密度粗帶所示。雖然圖9F中0.35nm范圍內的鍵對數量在系統弛豫20ns后不久略有下降，但波動的幅度和程度保持一致，呈正弦波趨勢。如圖9H所示，黃芩苷（橙色）與XDH（藍色）結合的快照從模擬的初始階段到最后階段都顯示配體與XDH活性位點緊密結合。圖9G中的每個殘基RMSF圖也支持時間序列分析，表明與黃芩素結合后XDH活性位點殘基的穩定性更高，波動更小。

圖9

總結：本研究通過網絡藥理學分析確定PF治療HUA所涉及的候選靶點和潛在機制，并在分子水平上充分闡明了黃芩苷作為黃嘌呤脫氫酶抑制劑的巨大潛力，為未來的藥物設計和開發帶來了希望。