題目：多組學和網絡藥理學方法揭示龜齡集通過調節花生四烯酸途徑緩解少弱畸形精子癥

英文名：Multi-omics and network pharmacology approaches reveal Gui-Ling-Ji alleviates oligoasthenoteratozoospermia by regulating arachidonic acid pathway

雜志：Phytomedicine

影響因子：6.7/Q1

發表時間：2024年10月

研究背景：  龜齡集（GLJ）是一種用于提高男性生育能力的傳統中藥配方。 少弱畸形精子癥(OAT)是導致男性不育的最重要原因之一。龜齡集現在可用于治療少弱畸形精子癥（OAT）。然而，GLJ的活性成分和機制尚不清楚。

研究思路：首先，建立環磷酰胺 (CTX)誘導的OAT大鼠模型，評價GLJ的療效。其次，進行基于血清/尿液的代謝組學和脂質組學和基于組織的轉錄組學，以發現大鼠的差異代謝物和基因。此外，基于多組學分析結果構建網絡藥理學以探索相關機制。最后，使用睪丸間充質基質細胞（TM3）的細胞實驗來驗證活性成分和關鍵代謝途徑。

圖1

研究結果：

1、GLJ可提高大鼠的精子活力并調節血清中的性激素水平

為了評估GLJ的療效，在動物實驗期間，每天都對所有大鼠進行稱重，并觀察它們的身體狀況。在給藥前的第1天至第14天，各組大鼠的體重差異無統計學意義。此外，GLJ-L組和GLJ-H組大鼠的毛色、精神狀態和攝食狀況均正常。本研究采用六磷酸肌醇（IP6）作為陽性對照藥物。IP組大鼠的精子數量和活性是OAT組大鼠的1.5倍。如圖2A所示，GLJ能有效減緩CTX引起的體重下降，在CTX進行OAT造模后的第15至17天，OAT大鼠的體重明顯下降，而GLJ-L組和GLJ-H組大鼠的體重下降速度明顯慢于OAT造模組。附睪中的精液是OAT最直觀的指標，對其進行了檢測和分析。圖2（B和C）顯示，OAT大鼠的精子數量和活力明顯減少，而GLJ大鼠的精子數量和活力則明顯增加。此外，OAT大鼠血清中的黃體生成素（LH）、卵泡刺激素（FSH）和睪酮（T）水平明顯降低，但使用GLJ治療后有所改善（圖2D-F）。如睪丸切片HE染色（圖2G-I）所示，OAT組（OAT vs. Sham）的曲細精管形態紊亂，管腔內的生精細胞數量明顯減少。隨后，OAT大鼠的曲細精管萎縮和生精細胞數量的減少在使用GLJ-H治療后得到緩解。

圖2

2、大鼠血清和尿液的代謝組學和脂質組學分析

通過分析OAT和GLJ引起的內源性差異代謝物（DMs），在尿液和血清樣本中分別鑒定出106種和85種內源性DMs，這些DMs在兩組之間的分布如圖3（A和B）所示。

此外，還繪制了反映體內含量變化的熱圖。如圖3（D和E）所示，代謝組學確定的88種DM（尿液中有37種DM，血清中有51種DM）受GLJ調節。血清樣本中65%受調控的代謝物是脂質代謝物。因此，對血清進行了脂質組分析，確定了159種脂質DMs（圖3C），54種受GLJ調控的DMs的熱圖結果見圖3F，其中包括33%的甘油磷脂、20%的甘油脂類、17%的類固醇、6%的鞘脂類等。在這些DM中，OAT組的AA水平明顯高于Sham組，而GLJ-L組和GLJ-H組則明顯低于OAT組。同時，與AA相關的脂質DMs（即PGE2、PGE2a、白三烯E4、12-HETE）在GLJ-L組和GLJ-H組明顯升高。

圖3

3、DM的功能分析

圖4A顯示，鞘脂代謝在所有3組的DMs中都富集，而甘油磷脂代謝和不飽和脂肪酸生物合成的通路在OAT vs. Sham組或GLJvs.OAT組的DMs中富集。發現了四條通路，包括鞘脂代謝、花生四烯酸代謝、甘油磷脂代謝和醚脂代謝（圖4B）。接著，由四條途徑和與途徑相關的DMs組成的四個連接模塊構成了一個代謝物-途徑網絡（圖4C）。該網絡中的8個DMs在OAT組和GLJ組中有相反的表達（圖4D），其中7個代謝物在OAT處理后增加，而在GLJ處理后則下調，尤其是花生四烯酸和鞘磷脂。在OAT組和Sham組中，有3條途徑被富集（圖4E），其中DM在11條途徑中發揮了關鍵作用（圖4F）。對包括5個連接模塊的DMs途徑網絡進行了分析（圖4G），在該網絡中，只有一種代謝物在OAT組與Sham組和GLJ組與OAT組中有相反的表達。如圖4H所示，去甲腎上腺素在OAT組中增加，而在GLJ-L組中減少。GLJ可能通過調節去甲腎上腺素來提高男性生育能力。

圖4

4、大鼠睪丸差異表達基因的鑒定和功能分析

為了闡明GLJ治療大鼠與未治療大鼠之間基因轉錄水平的變化，對差異表達基因進行了分析，最終確定了305個DEGs。將OAT組與Sham組和GLJ組與OAT組中相反表達的23個DEGs（圖5a和B）輸入STRING進行功能注釋，發現這些基因富集了3個通路，這些通路與免疫和內分泌系統的生物過程有關。并進行了GO、KEGG分析（圖5C-E）。

圖5

5、多組學結果和GLJ潛在靶標的綜合網絡分析

利用網絡藥理學技術對代謝組學、脂質組學和轉錄組學數據進行了綜合分析,得到GLJ基因-代謝物網絡（圖6A）。篩選確定了前30條通路（圖6B），包括內分泌系統、免疫系統和脂質代謝（內分泌抵抗、T細胞受體信號通路和類固醇激素生物合成等）。構建GLJ基因-DM網絡,分析DM與OAT中GLJ的治療密切相關的調控基因（圖6C-D）。然后，將目標得分定義為藥材與藥材配對的數量。12個重要靶標的靶向得分如圖6E所示。建立了"藥材-成分-關鍵分子-途徑"網絡（圖6F）。在19個關鍵靶點中，花生四烯酸是網絡中最重要的代謝物節點。因此，預計花生四烯酸代謝在GLJ治療OAT的過程中具有關鍵作用。

圖6

6、GLJ及其成分對睪酮分泌的影響

如圖7（A-F）所示，GLJ以濃度依賴性的方式顯著提高了睪酮分泌水平。在所測試的八種化合物中，發現補骨脂素（psoralen）對睪酮分泌的影響maximum，在5μM時就能顯著增強睪酮分泌，而異甘草苷（isoliquiritin）、人參皂苷Ro（ginsenoside Ro）、甘草素（liquiritigenin）和異補骨脂素（isopsoralen）也能顯著提高T水平（在25μM時，T水平highest可達0.448±0.041ng/mL）。至于淫羊藿苷（liquiritin）、異補骨脂素（icariin）和熊果酸（ ursolic acid），淫羊藿苷（liquiritin）對T水平的影響有限，而異補骨脂素（icariin）和熊果酸（ ursolic acid）對TM3具有抗增殖特性。

圖7

7、花生四烯酸（AA）代謝參與睪酮分泌

如圖7H-I所示，10-M-M的AA在處理3h和24h后極大地促進了TM3中睪酮分泌，但在處理3h和24h之間睪酮分泌沒有顯著差異。而且，GLJ（80ng/ml）可以促進AA的這種作用。圖7J顯示，單獨使用GLJ（80ng/ml）可顯著增加TM3的睪酮分泌，而阿司匹林（25μM，環氧化酶抑制劑）可顯著降低GLJ的促進作用，抑制率為50%。與單獨使用阿司匹林相比，聯合使用阿司匹林和齊留通（25μM，脂氧合酶抑制劑）對GLJ的刺激具有相似的抑制作用。因此，加入阿司匹林后，GLJ對TM3分泌睪酮的促進作用明顯受到抑制，而齊留通則沒有。此外，給予AA、阿司匹林和齊魯妥對TM3細胞的增殖沒有有害影響。

總結：本文采用多組學+網絡藥理學方法，揭示GLJ對環磷酰胺誘導的OAT大鼠具有療效，可調節脂質代謝和氨基酸代謝紊亂。花生四烯酸代謝可能是一個關鍵途徑，而六個原型化合物是GLJ的潛在關鍵活性成分。傲星生物有豐富的分析方案、完善的下游驗證、機制研究服務，一對一專屬服務為您排憂解難，助您輕松應對畢業和晉升！