題目：二甲雙胍通過(guò)調(diào)節(jié)FoxO1核胞漿穿梭改善HPRT1靶向嘌呤代謝并修復(fù)NR4A1介導(dǎo)的自噬治療絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥

英文名：Metformin improves HPRT1-targeted purine metabolism and repairs NR4A1-mediated autophagic flux by modulating FoxO1 nucleocytoplasmic shuttling to treat postmenopausal osteoporosis

雜志：Cell Death & Disease

影響因子：8.1/Q1

發(fā)表時(shí)間：2024年11月

研究背景：骨質(zhì)疏松癥是一種主要的退行性代謝性骨病，威脅著絕經(jīng)后婦女的生命和健康。由于檢測(cè)方法和預(yù)防策略意識(shí)的局限性，骨質(zhì)疏松癥治療的目的更多的是延緩進(jìn)一步惡化，而不是從根本上糾正骨量。本研究旨在闡明絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥的發(fā)病機(jī)制并優(yōu)化治療方案。

研究思路：實(shí)驗(yàn)基于先前的發(fā)現(xiàn)，即氧化應(yīng)激介導(dǎo)雌激素缺乏后骨代謝失衡。通過(guò)能量代謝靶向代謝組學(xué)，揭示了嘌呤代謝紊亂是誘導(dǎo)骨組織氧化損傷的主要機(jī)制，這通過(guò)使用來(lái)自人類數(shù)據(jù)庫(kù)的機(jī)器學(xué)習(xí)數(shù)據(jù)得到了驗(yàn)證。黃嘌呤和黃嘌呤氧化酶用于治療成骨細(xì)胞，構(gòu)建嘌呤代謝紊亂模型。X/XO處理后成骨細(xì)胞活性和分化能力下降。轉(zhuǎn)錄組測(cè)序表明，自噬通量損傷與嘌呤代謝誘導(dǎo)的成骨細(xì)胞氧化應(yīng)激有關(guān)。此外，進(jìn)行血清代謝組學(xué)結(jié)合網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)，以確定二甲雙胍治療絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥的藥理機(jī)制。HPRT1是從樞紐基因過(guò)濾的潛在靶標(biāo)，F(xiàn)oxO1信號(hào)傳導(dǎo)是介導(dǎo)二甲雙胍在成骨細(xì)胞中作用的關(guān)鍵途徑。還揭示了SIRT3介導(dǎo)的脫乙酰化促進(jìn)了FoxO1的核定位，從而增加了HPRT1的表達(dá)。HPRT1上調(diào)促進(jìn)嘌呤合成代謝，阻止嘌呤分解代謝引起的ROS積累，以逆轉(zhuǎn)成骨細(xì)胞的氧化損傷。

研究結(jié)果：

1、骨能量代謝靶向代謝組學(xué)和機(jī)器學(xué)習(xí)

對(duì)假手術(shù)組和卵巢切除組樣本進(jìn)行能量代謝靶向代謝組檢測(cè)（圖1A，B）。隨后進(jìn)行重復(fù)相關(guān)分析（圖1C），最小偏二乘判別分析（OPLS-DA）（圖1D），篩選出31種有效差異豐富代謝物（圖1E-G），生成差異豐富代謝物的熱圖（圖1H）。如圖1I，J所示，嘌呤代謝在這兩組之間存在顯著差異。嘌呤相關(guān)代謝物在OVX組中積累。發(fā)現(xiàn)KKNN和SVM模型在預(yù)測(cè)骨質(zhì)疏松方面表現(xiàn)出突出的性能，這從框圖中每個(gè)模型的平均AUC中可以明顯看出（圖1K，L），KKNN模型的驗(yàn)證結(jié)果通過(guò)接收器工作特征（ROC）曲線分析進(jìn)一步突出了其outstanding性，曲線下面積（AUC）值為0.875（圖1M）。這些結(jié)果表明嘌呤代謝相關(guān)基因?qū)τ趨^(qū)分絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥患者和健康對(duì)照具有很高的診斷價(jià)值。

圖1

2、代謝組學(xué)和網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的綜合分析

micro-CT結(jié)果表明二甲雙胍可以防止骨丟失并改善OVX小鼠的骨顯微結(jié)構(gòu)（圖2A）。進(jìn)行了血清代謝組學(xué)分析，以確定OVX組和二甲雙胍實(shí)驗(yàn)組之間差異豐富的代謝物（圖2B，）。這兩組樣品之間的差異通過(guò)多模態(tài)PCA可視化（圖2C）。所有差異豐富的代謝物根據(jù)其內(nèi)容在圖2D中列出。此外，進(jìn)行了網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)分析，獲得了1871個(gè)骨質(zhì)疏松相關(guān)靶點(diǎn)和47個(gè)二甲雙胍相關(guān)靶點(diǎn)（圖2E）。從分子功能（MF）、生物過(guò)程（BP）和細(xì)胞成分（CC）三個(gè)方面分析基因功能，并確定了前十大術(shù)語(yǔ)（圖2G）。GO分析后，根據(jù)MF分析共鑒定出5個(gè)功能組（圖2H-I）。KEGG網(wǎng)絡(luò)如圖2J所示。通過(guò)將網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)分析揭示了HPRT1和CANT1是上述樞紐基因，受影響的途徑是嘌呤代謝（圖2K）。

圖2

3、二甲雙胍減輕X/XO誘導(dǎo)的成骨細(xì)胞損傷

通過(guò)CCK-8和流式細(xì)胞儀測(cè)定（圖3A，B）確定具有足夠黃嘌呤濃度（100μmol）用于分解的黃嘌呤氧化酶的the best濃度（圖3A，B）。結(jié)果顯示，25mU/ml黃嘌呤氧化酶顯著降低了生存能力，同時(shí)增加了凋亡成骨細(xì)胞的百分比（圖3A，C）。因此，25mU/ml黃嘌呤氧化酶用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。隨后探索了二甲雙胍在治療絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥中的作用。實(shí)驗(yàn)顯示，200mmol二甲雙胍顯著逆轉(zhuǎn)了X/XO治療引起的細(xì)胞生存能力和凋亡細(xì)胞百分比的下降（圖3D-F）。因此，200mmol二甲雙胍用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

圖3

4、二甲雙胍增加HPRT1表達(dá)以逆轉(zhuǎn)成骨細(xì)胞的氧化損傷

對(duì)股骨組織樣本進(jìn)行免疫組織化學(xué)分析，以確認(rèn)HPRT1在體內(nèi)表達(dá)的變化（圖4A）。HPRT1的表達(dá)隨著二甲雙胍體外干預(yù)而增加（圖4B，C）。HPRT1表達(dá)抑制后凋亡細(xì)胞的百分比增加（圖4D，E）。二甲雙胍增加了相關(guān)蛋白的比例，這在HPRT1沉默后被逆轉(zhuǎn)（圖4B，C）。如圖4F所示，二甲雙胍在X/XO處理后恢復(fù)了成骨細(xì)胞的分化和礦化能力。沉默HPRT1表達(dá)逆轉(zhuǎn)了二甲雙胍的治療效果，結(jié)果表明，線粒體膜電位隨著X/XO處理而降低，ROS水平增加，二甲雙胍的治療效果通過(guò)沉默HPRT1而逆轉(zhuǎn)（圖4G，H，I）。細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度也顯示了氧化損傷的程度（圖4J）。這些結(jié)果表明二甲雙胍上調(diào)HPRT1的表達(dá)，以改善成骨細(xì)胞中X/XO誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激損傷。

圖4

5、SIRT3介導(dǎo)的FoxO1脫乙酰化促進(jìn)其核定位以調(diào)節(jié)HPRT1表達(dá)

OVX和二甲雙胍治療組的FoxO1水平低于假手術(shù)組（圖5a）。在細(xì)胞水平，添加As184來(lái)抑制FoxO1表達(dá)，HPRT1蛋白水平下降（圖5B，C）。Sirt3基因沉默逆轉(zhuǎn)了這些影響，并降低了相應(yīng)HPRT1蛋白的水平（圖5D-G）。二甲雙胍處理增加了FoxO1蛋白定位于核的比例，但Sirt3沉默逆轉(zhuǎn)了這種影響（圖5H）。與野生型細(xì)胞相比，K245R轉(zhuǎn)染細(xì)胞中FoxO1的核定位增加，相應(yīng)地，HPRT1蛋白水平升高（圖5I，J，L）。K245R組顯示更多的FoxO1蛋白核定位，而K245Q組顯示相反（圖5K）。這些發(fā)現(xiàn)表明SIRT3對(duì)FoxO1的調(diào)控是通過(guò)位點(diǎn)-245的乙酰化實(shí)現(xiàn)的。

圖5

6、轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)表明，自噬與X/XO誘導(dǎo)的氧化損傷有關(guān)

與對(duì)照組相比，X/XO組共鑒定出2028個(gè)上調(diào)基因和2184個(gè)下調(diào)基因（圖6A和S1D）。GO分析表明，DEG富集在“利用自噬機(jī)制的加工”、“自噬”、“溶酶體膜”、“溶酶體”、“溶解液泡”和“自噬體”（圖6B，C）中。KEGG分析還顯示了溶酶體和自噬相關(guān)通路的富集（圖6D-F）。此外，將這些參數(shù)的變化與二甲雙胍治療后觀察到的變化進(jìn)行了比較。結(jié)果顯示二甲雙胍治療后248個(gè)上調(diào)基因和301個(gè)下調(diào)基因（圖6G）。GO分析還揭示了二甲雙胍可以調(diào)節(jié)嘌呤核糖核苷和氧化還原輔酶代謝（圖6H，I）。KEGG分析揭示富集在FoxO信號(hào)通路和自噬相關(guān)通路中的基因與上述發(fā)現(xiàn)一致（圖6J，K）。為了鑒定X/XO和二甲雙胍都參與自噬調(diào)控的因素，構(gòu)建了DEGs的維恩圖（圖6L）,根據(jù)基因的差異對(duì)其進(jìn)行排序，并選出前15個(gè)基因進(jìn)行進(jìn)一步篩選。

圖6

7、自噬通量受損介導(dǎo)X/XO誘導(dǎo)的成骨細(xì)胞氧化損傷

使用透射電鏡驗(yàn)證自噬和溶酶體的變化,二甲雙胍大大增加了自溶酶體的數(shù)量，減少了自噬體的數(shù)量（圖7A）。兩種自噬標(biāo)志物的表達(dá)在OVX組比假手術(shù)組更大，但在二甲雙胍實(shí)驗(yàn)組更低，這與轉(zhuǎn)錄組分析的結(jié)果一致（圖7B）。然后，使用Western blotting檢測(cè)p62和LC3BII/I的蛋白質(zhì)表達(dá)水平，這表明在X/XO處理后有所增加（圖7C，D）。此外，檢測(cè)了成骨細(xì)胞活性對(duì)CQ處理的響應(yīng)。結(jié)果顯示，二甲雙胍對(duì)細(xì)胞凋亡和分化的治療作用被CQ逆轉(zhuǎn)（圖7E，F(xiàn)，G）。與二甲雙胍治療相比，CQ添加增加了細(xì)胞內(nèi)ROS水平，降低了X/XO環(huán)境中的線粒體膜電位（圖7H，I）。細(xì)胞內(nèi)鈣濃度的增加也表明響應(yīng)CQ治療的氧化損傷程度增加（圖7J）。此外，成骨細(xì)胞被mRFP-GFP-LC3腺病毒感染，以準(zhǔn)確觀察和評(píng)估自噬的變化。X/XO組的結(jié)果表明黃點(diǎn)（自噬體）比例增加，紅點(diǎn)（自溶酶體）比例減少，這表明自噬通量被阻斷。二甲雙胍減弱了斑點(diǎn)比例的變化，但在CQ治療后逆轉(zhuǎn)（圖7K，L）。這些結(jié)果表明自噬通量受損對(duì)于X/XO誘導(dǎo)的成骨細(xì)胞氧化損傷至關(guān)重要。

圖7

8、二甲雙胍通過(guò)恢復(fù)Nr4a1介導(dǎo)的自噬通量來(lái)改善X/XO誘導(dǎo)的氧化損傷

為了確定Nr4a1在調(diào)節(jié)自噬中的作用，首先進(jìn)行免疫組織化學(xué)分析以確定骨組織中的Nr4a1含量（圖8A）。隨后通過(guò)添加Nr4a1-siRNA生成Nr4a1沉默的細(xì)胞以進(jìn)一步驗(yàn)證。Western blotting顯示（圖8B，C）。如圖8D，E所示，通過(guò)沉默Nr4a1基因，黃點(diǎn)（自噬體）與紅點(diǎn)（自溶酶體）比例的變化被逆轉(zhuǎn)。Western blotting結(jié)果表明，Nr4a1蛋白的表達(dá)水平隨著X/XO處理而降低，HPRT1沉默后二甲雙胍的治療效果被逆轉(zhuǎn)（圖8F）。最后，構(gòu)建HPRT1-overexpressing和Nr4a1沉默的細(xì)胞，以評(píng)估HPRT1是否可以通過(guò)Nr4a1進(jìn)一步調(diào)節(jié)自噬通量。與X/XO組相比，HPRT1-overexpressing組LC3BII/I和p62的表達(dá)降低，Nr4a1基因的沉默逆轉(zhuǎn)了這些影響（圖8G，H）。自噬通量測(cè)試結(jié)果顯示，HPRT1過(guò)表達(dá)后黃點(diǎn)（自噬體）比例下降，紅點(diǎn)（自溶酶體）比例增加，這種影響通過(guò)沉默Nr4a1基因而逆轉(zhuǎn)（圖8I，J）。

圖8

總結(jié)：本文采用“代謝組學(xué)＋轉(zhuǎn)錄組+機(jī)器學(xué)習(xí)＋網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)+細(xì)胞自噬”深度挖疾病機(jī)制的神級(jí)思路，想不發(fā)一區(qū)都難！文章方法易復(fù)現(xiàn)，傲星生物不僅具有豐富的分析經(jīng)驗(yàn)、還提供完善的下游驗(yàn)證、機(jī)制研究服務(wù)，一對(duì)一專屬服務(wù)為您排憂解難，助您輕松應(yīng)對(duì)畢業(yè)和晉升！