題目：通過隱丹參酮靶向平滑肌細胞Keap1-Nrf2-GSDMD-焦亡軸可防止腹主動脈瘤形成

英文名：Targeting the smooth muscle cell Keap1-Nrf2-GSDMD-pyroptosis axis by cryptotanshinone prevents abdominal aortic aneurysm formation

雜志：THERANOSTICS

影響因子：12.4

發(fā)表時間：2024年10月07

研究背景：腹主動脈瘤（AAA）是一種炎癥性、致命的主動脈疾病，目前缺乏任何有效的藥物。隱丹參酮（CTS）是一種突出且廉價的生物活性物質，來源于丹參Bunge，這是一種眾所周知的草藥，通過其強大的抗炎特性治療心血管疾病。然而，CTS對AAA形成的治療效果仍然未知。

研究思路：為探討CTS對AAA的治療效果，采用多種實驗方法，主要包括AAA小鼠模型建立、實時聚合酶鏈反應（PCR）、RNA測序、蛋白質印跡、免疫共沉淀、掃描/透射電子顯微鏡（SEM/TEM）、酶聯免疫吸附測定（ELISA）、seahorse分析、免疫組化和共聚焦成像。在這項研究中，作者證明CTS抑制了輸注AngII的載脂蛋白E敲除（ApoE^-/-）小鼠中AAA的形成。網絡藥理學和轉錄組測序分析的結合表明，血管平滑肌細胞（VSMC）中Keap1-Nrf2通路的激活和程序性細胞死亡的調節(jié)與CTS的抗AAA作用密切相關。利用分子對接，結合細胞熱位移測定（CETSA）和等溫滴定量熱法（ITC），在CTS和Keap1之間的Arg415位點建立了一個特定的結合位點。

研究結果：

1、CTS抑制AngII誘導的ApoE-/- 小鼠AAA形成

使用了AngII誘導的小鼠AAA模型，十二周大的雄性ApoE-/-小鼠在AngII輸注當天每天給予低劑量或高劑量的CTS（CTS-L或CTS-H）或載體（圖1A）。在實驗終點，AngII輸注組的收縮壓高于生理鹽水組，無論是否使用CTS治療都沒有顯著差異（圖1B）。高劑量的CTS顯著提高了小鼠AAA模型中的存活率（圖1C-D）。相比之下，CTS-L組只有46.7%（7/15）的小鼠和CTS-H組只有26.7%（4/15）的小鼠出現了AAA（圖1D）。還觀察到CTS治療后maximum腹主動脈直徑顯著降低（圖1E-F）。

圖1

H&E和EVG染色表明CTS大大減輕了彈性蛋白的損傷和惡化（圖1G-I）。此外，CTS治療導致劑量依賴性相當大且陽性區(qū)域較小（圖1J）。AngII灌注小鼠主動脈中層的VSMCs與生理鹽水對照小鼠相比，α-SMA和SM22α水平顯著下降，而CTS有效地挽救了α-SMA和SM22α的下降（圖1J-L）。CTS處理小鼠主動脈中的MMP活性顯著降低（圖1M-N）。這些結果表明CTS阻礙AAA的形成，并維持血管平滑肌細胞穩(wěn)態(tài)AngII誘導小鼠AAA模型。

2、CTS在體外AAA模型中協調VSMC表型、炎癥、氧化應激和線粒體功能

CTS劑量依賴性地抑制了TNF-α誘導的血管細胞粘附分子-1（VCAM-1）和基質金屬蛋白酶（MMP2、3和9）的蛋白表達，這在RAVSMCs（圖2A）和MAVSMCs中起著關鍵作用。如圖2B所示，CTS以劑量相關的方式增加彈性蛋白表達，同時防止TNF-α-誘導的RAVSMCs和MAVSMCs中SMC收縮表型標志物SM22α和α-SMA表達的減少。通過DHE染色和流式細胞術評估的ROS水平在TNF-α或AngII處理中顯著升高，而CTS有效地抑制了這種升高（圖2C-H）。因此，抗氧化劑超氧化物歧化酶（SOD）水平和ATP水平降低，而在TNF-α暴露的VSMCs和AngII處理的小鼠血清中，氧化應激指標丙二醛（MDA）水平升高，CTS阻止了這種影響（圖2I-L）。CTS處理減少了細胞培養(yǎng)上清液中的LDH釋放（圖2M）。CTS處理后，細胞表現出接近正常的形態(tài)，沒有明顯的超微結構損傷（圖2N）。此外，TNF-α處理誘導VSMCs的耗氧率（OCR）和細胞外酸化率（ECAR）顯著增加，而CTS處理有效地逆轉了TNF-α誘導的線粒體功能障礙和糖酵解增加（圖2O-P）。將VSMCs暴露于TNF-α會導致細胞質dsDNA和mtDNA數量的增加，而CTS處理逆轉了這種影響（圖2Q-R）。

總體而言，這些發(fā)現表明CTS抑制VSMC炎癥、ROS產生和線粒體損傷，從而在TNFα誘導的AAA 體外模型中維持VSMC穩(wěn)態(tài)。

圖2

3、網絡藥理學結合RNA-seq分析表明，CTS激活Keap1-Nrf2-HO-1通路并抑制細胞死亡通路

為了繪制AAA中CTS交互目標的全局地圖，使用了網絡藥理學（圖3Aa-b）。在這個集中的網絡中，以黃色標記的十個目標在AAA中至關重要，并且已被證明與AAA的進展密切相關，特別是Keap1-Nrf2-HO-1信號軸（圖3Ac-d）。

圖3

CTS主要富集的途徑集中在炎癥反應和細胞死亡的類別上（圖3B）。火山圖顯示，當暴露于CTS時，由轉錄因子Nrf2調節(jié)的靶基因增加，與其他基因相比，Hmox-1（HO-1的基因名稱）表現出最顯著的上調（圖3C）。熱圖顯示與載體組相比，CTS實驗組中Nrf2靶基因的高轉錄（圖3D）。此外，差異表達基因的KEGG分析表明，CTS對炎癥和細胞死亡途徑的調節(jié)有顯著影響，與網絡藥理學的發(fā)現一致（圖3E）。在GO富集分析中，很明顯CTS對“Keap1-Nrf2途徑”產生了影響，與網絡藥理學的結果一致（圖3F）。

4、CTS激活Keap1-Nrf2-HO-1通路并抑制VSMC中的焦亡通路以預防AAA

根據網絡藥理學和RNA-seq的發(fā)現，CTS治療在體內誘導了AngII灌注小鼠主動脈介質中VSMCs中Nrf2和HO-1的穩(wěn)健蛋白表達（圖4A-B）。進一步分析CTS對體外培養(yǎng)的VSMCs的影響，發(fā)現Keap1蛋白表達減少，Nrf2及其靶蛋白HO-1和NQO1顯著增加（圖4C）。Nrf2蛋白水平在細胞核和細胞質中均有所增加，其中增加在細胞核中更為明顯（圖4D）。免疫熒光染色進一步證實了這一點（圖4E），表明Nrf2通路顯著激活。

圖4

RNA-seq數據顯示，在TNF-α刺激的VSMCs中，Gsdmd的轉錄水平升高，而CTS治療緩解了這種升高（圖5a）。通過蛋白質印跡檢測到焦亡途徑中關鍵靶點的蛋白質水平，包括NLRP3、Cle-Caspase1、N-GSDMD、IL-1β和IL-18，并顯示在AngII注入的小鼠主動脈組織或TNF-α處理的RAVSMCs中顯著增加，同時被CTS抑制（圖5B-E）。此外，IHC證實了小鼠主動脈橫截面中NLRP3、Caspase1和GSDMD的表達（圖5F-G），ELISA測定證實了小鼠血清中IL-1β、IL-18和其他兩種關鍵的AAA相關細胞因子（TNF-α和IL-6）的釋放（圖5H）。最后，用相差顯微鏡和掃描電鏡觀察焦亡的形態(tài)學變化。在相差顯微鏡下，細胞呈現氣球狀形態(tài)。此外，SEM觀察到VSMCs在TNF-α刺激下細胞大小腫脹和細胞膜上形成孔隙的明顯跡象，而CTS治療改善了異常形態(tài)學（圖5I-J）。

圖5

5、CTS直接結合Keap1的Arg415殘基激活Nrf2通路，改善氧化應激和炎癥

使用CETSA、分子對接分析和ITC來確定CTS和Keap1之間是否存在直接接觸。測定表明CTS對增加Keap1的熱穩(wěn)定性有實質性影響，Tm50為11.68°C（圖6A）。此外，ITDRF-CETSA測定提供了進一步的證據，證明了IC50為2μM的CTS對Keap1蛋白的劑量依賴性結合和顯著穩(wěn)定（圖6B）。分子對接分析顯示CTS對Keap1的Arg415（R415）殘基具有highest的親和力（圖6C）。Keap1^R415K蛋白與CTS的熱穩(wěn)定性顯著下降，與Keap1^WT蛋白相比，Tm50值為7.41°C（圖6D）。CTS對Keap1WT蛋白表現出更高的結合親和力，而對突變的Keap1沒有觀察到明顯的結合（圖6E-F）。此外，Co-IP測定顯示CTS治療顯著降低了Keap1蛋白水平與VSMCs中的Nrf2結合（圖6G）。還觀察到CTS處理后Nrf2的泛素化水平降低（圖6H）。這些發(fā)現表明CTS直接與Keap1中的Arg415殘基相互作用，從而阻礙Keap1和Nrf2之間的結合，阻止Nrf2泛素化和隨后的降解，導致Nrf2逃逸和易位到細胞核以開始細胞保護基因的轉錄。

圖6

DHE染色和流式細胞儀顯示，在轉染Keap1-WT的VSMCs中，CTS處理后ROS水平顯著提高，但在Keap-R415K轉染的細胞中沒有（圖7A-B）。此外，將Keap1^R415K轉染VSMCs顯著抑制CTS誘導的Nrf2和HO-1蛋白表達上調（圖7C-D）。此外，Western blot表明，CTS在轉染Keap1^WT的VSMCs中具有抗炎和抗焦亡作用，但在Keap1^R415K中沒有（圖7C-D）。總之，CTS與Keap1中415位點氨基酸的結合對改善至關重要。

圖7

6、在體外 AAA模型中，抑制Keap1-Nrf2通路可逆轉CTS的保護作用

在ML385存在的情況下，CTS對MMPs（MMP2、3和9）以及VCAM-1蛋白水平的消除被完全消除（圖8A）。觀察到MMPs和AAA相關細胞因子（Il1b、Il6和Ccl2）的mRNA水平的類似結果（圖8B）。此外，ML385部分損害了CTS恢復彈性蛋白和SMC收縮表型標志物（SM22α和α-SMA）蛋白水平的能力（圖8C）。ML385處理也逆轉了CTS介導的抗氧化能力，如使用流式細胞術（圖8D-E）和DHE染色檢測ROS水平所示（圖8F-G）此外，CTS對NLRP3-Cle-Caspase1-N-GSDMD介導的焦亡的抑制作用通過ML385給藥被廢除（圖8H）?？傊?，這些結果表明，CTS通過激活Nrf2在體外模型中在AAA中維持VSMC穩(wěn)態(tài)并抑制VSMC焦亡。

圖8

7、VSMC特異性 Nfe2l2 敲低消除了小鼠AAA模型中CTS的保護作用

熒光成像顯示AAV特異性感染主動脈而不是其他器官（圖 9 A）。小鼠主動脈的橫截面顯示GFP在中層中特異性表達（圖 9 B）。此外，western blot分析表明，在AAV2病毒存在的情況下，大腦中Nrf2蛋白的表達是一致的，而主動脈明顯降低（圖 9 C）。將病毒注射到ApoE-/-小鼠中，以建立上述AngII誘導的小鼠AAA模型（圖 9 D）。正如預期的那樣，觀察到CTS有效抑制了AngII注入的ApoE-/- 小鼠的AAA形成。有趣的是，當Nrf2在小鼠VSMC中沉默時，抑制作用減弱，如AAA發(fā)生率增加、存活率降低和腹主動脈maximum直徑增加所示（圖 9 E-H）。此外，組織學評估描述了Nrf2缺陷與CTS治療效果受損之間的直接聯系。這表現為顯著的外膜增厚、彈性蛋白碎裂增加以及主動脈內層內膠原含量的顯著降低（圖 9 I-J）。免疫組織化學分析證實了這些發(fā)現，表明AAV介導的shNfe2l2 有效抑制了CTS誘導的VSMC中Nrf2的穩(wěn)定和激活（圖 9 K）。進一步的免疫熒光研究表明，CTS給藥顯著上調了VSMC中的Nrf2表達。使用AAV-shNfe2l2 阻礙了這種上調，同時導致α-SMA蛋白水平降低（圖 9 L）。通過ELISA檢測細胞因子，包括IL-1β、IL-6、IL-18和TNF-α，結果顯示與AngII輸注小鼠相比，CTS處理的小鼠明顯減少。然而，CTS的治療效果在很大程度上被Nrf2敲低所抵消（圖 9 M）。

圖9

此外，免疫組織化學染色顯示，VSMCs中的Nrf2敲低通過增加炎癥、促進VSMC表型轉換和提高MMP水平來阻斷CTS的治療效果。盡管CTS治療可以通過激活Nrf2介導的通路和彈性蛋白水平來改善AAA，但還是觀察到了這一點（圖 10 A），突出了Nrf2是AAA治療的關鍵治療靶點。Western blot分析進一步證明，Nrf2敲低大大削弱了Nrf2通路的激活以及NLRP3和焦亡通路的抑制（圖 10 B）。綜上所述，這些數據表明CTS通過激活Nrf2介導的抗炎作用和抑制NLRP3-caspase1引發(fā)的細胞焦亡，在治療AAA方面很有希望。

圖10

總結：本文通過網絡藥理學與轉錄組測序、分子對接并結合細胞熱位移測定（CETSA）和等溫滴定量熱法（ITC）等濕實驗，探究隱丹參酮 (CTS)對AAA的治療效果的方式，是個很好的例子。傲星生物深耕生信分析十余載，有豐富的實驗方案、完善的下游驗證、機制研究服務，一對一專屬服務為您排憂解難，助您輕松應對畢業(yè)和晉升！