題目：補腎健脾調血湯（BJTD）通過激活SIRT1/NRF2通路改善子宮衰老誘導的氧化應激和細胞凋亡

英文名：Bushen Jianpi Tiaoxue Decoction (BJTD) ameliorates oxidative stress and apoptosis induced by uterus ageing through activation of the SIRT1/NRF2 pathway

雜志：Phytomedicine

影響因子：6.7/Q1

發表時間：2024年11月22日

研究背景：子宮老化是導致老年女性生育能力下降的關鍵因素，也與月經失調、子宮內膜炎和子宮腺肌病有關。補腎健脾調血湯（BJTD）是一種中藥制劑，用于改善女性生殖系統的內分泌失調，并廣泛應用于與衰老相關的子宮內膜疾病。然而，其改善子宮衰老的機制尚未得到徹底研究。

研究思路：使用蘇木精和伊紅染色觀察形態學變化，使用Masson染色評估膠原蛋白沉積，并使用Western blot檢測凋亡相關分子。確定建模劑量后，以2次劑量進行BJTD干預，并測量氧化應激和細胞凋亡相關基因和蛋白質的表達。使用TUNEL檢測試劑盒和AnnexinV/FITC-PI檢測試劑盒評估細胞凋亡水平。通過UPLC-MS測定BJTD的主要成分，并使用網絡藥理學和分子對接探索BJTD作用的潛在靶點和機制。提取含BJTD的血清（BJTD-S）并使用人子宮內膜基質細胞（hESC） 進行體外實驗，以初步確定受影響的通路。

研究結果：

1、D-半乳糖誘導衰老激活子宮炎癥、膠原沉積和細胞凋亡

最初采用兩種建模方法，即頸部后連續皮下注射5周，分別使用200毫克/千克/天（D-Gal 200）和600毫克/千克/天（D-Gal 600）的劑量來誘導子宮衰老，以明確建模劑量（圖1A）。結果表明，兩種建模方法都降低了子宮指數，但只有D-Gal 600建模導致統計學上顯著差異（圖1B）。此外，兩種建模方法都增加了子宮組織中TNF-α和IL-1β的水平，表明炎癥反應的促進作用（圖1C-D）。HE染色結果顯示，用兩種劑量的D-Gal建模的小鼠表現出與衰老相關的相似形態學變化（圖1E）。Masson染色結果顯示，兩種劑量的D-Gal建模導致子宮組織膠原纖維沉積（圖1F）。Western blot結果顯示，兩種建模小鼠的衰老標志物p53顯著增加。雖然相對于對照組，BCL-2水平下調，BAX表達上調，但僅在D-Gal 600模型中觀察到統計學意義上的差異（圖1G-J）。

圖1

2、BJTD改善D-Gal誘導的炎癥和氧化應激

選擇D-Gal 600建模為基礎，研究BJTD的功效（圖1A）。采用RT-qPCR檢測部分senescence-associated分泌表型（SASP）標志物的mRNA水平（圖2A-B）。隨后，使用ELISA試劑盒檢測蛋白質水平，表明BJTD干預可能通過post-transcriptional調控發揮其效果（圖2C-D）。D-Gal顯著降低SOD和GSH-Px的表達，以及T-AOC水平。兩種劑量的BJTD均顯著提高T-AOC，而只有BJTDH顯著提高SOD和GSH-Px水平。此外，D-Gal顯著增加MDA水平，BJTDH和BJTDL均顯著降低MDA水平（圖2E-H）。

圖2

3、BJTD抑制D-Gal誘導的細胞凋亡中炎癥誘導激活的凋亡級聯信號

HE染色結果顯示，BITD部分減輕了D-Gal誘導的子宮形態損傷，減少了子宮內膜上皮細胞腫脹和基質細胞空泡（圖3A）。TUNEL-POD染色顯示，兩種劑量的BJTD給藥均顯著減少了凋亡細胞的數量（圖3B）。COX-2和Caspase8的表達在組間沒有顯著差異（圖3C-J）。

圖3

4、BJTD-S抑制D-Gal誘導的hESCs細胞凋亡

使用hESCs進行了體外實驗，SA-β-gal染色顯示，持續24小時的200m MD-Gal干預增加了陽性細胞的數量，表明存在急性衰老（圖4A）。CCK-8結果顯示，白藜蘆醇在hESCs中的IC50為27.17μM;因此，干預濃度設置為13μM（圖4B）。在用兩種不同劑量的含藥物血清和白藜蘆醇干預后，D-Gal誘導的hESC細胞死亡受到抑制（圖4C-E）。白藜蘆醇能夠逆轉D-Gal誘導的氧化應激，而只有高濃度的BJTD-S才能抑制氧化應激損傷（圖4F-G）。細胞凋亡實驗表明，白藜蘆醇和BJTD-S均顯著降低了D-Gal誘導的hESC細胞凋亡的增加（圖4I）。

圖4

5、hESC衰老的差異基因表達和富集分析

對GEO數據庫中的GSE160702數據集進行了分析，獲得70個DEGs（圖5A）。并進行了GO富集分析、GSEA分析，結果表明，分子功能富集的最重要條目是微管蛋白結合，而其他條目則不顯著，該基因集與細胞周期停滯、氧化磷酸化和DNA損傷修復有關（圖5B-D）。總之，對這些轉錄組數據的進一步分析揭示了與子宮基質細胞衰老相關的基因以及與之相關的途徑。

圖5

6、網絡藥理學和分子對接揭示了SIRT1是BJTD改善子宮衰老的潛在靶點

根據UPLC-MS檢測（圖6）、文獻統計和數據庫預測，獲得了化合物的251個潛在靶標和疾病121個潛在靶點（圖7A）。以往研究表明，SIRT1是這些靶點之一，從PDB數據庫下載了SIRT1的兩種構型（4I5I和4ZZI）的結構，從PubChem獲得了acteoside、astragalin、formononetin、hyperin、narigenin、quercetin、tiliroside和trigoneline的3D結構。預處理后，使用AutoDockVina進行分子對接，結果表明，具有SIRT1兩種構型的每個分子的結合能均小于-5kcal/mol。其中，替利羅苷表現出the best的結合親和力，對4I5I的結合能為-10kcal/mol，對4ZZI的結合能為-10.3kcal/mol（圖7B）。具有兩種構型的每個分子的the best結合位置如圖7C所示。

圖6

圖7

7、BJTD介導SIRT1/NRF2通路改善子宮的衰老

對對照組、D-Gal模型和BJTD-S干預組的hESCs進行NRF2和SIRT1的雙標簽免疫熒光染色。結果表明，NRF2和SIRT1主要分布在hESCs的細胞質中，建模后熒光表達降低，而BJTD干預增強了它們的表達（圖8A）。使用Western blot對蛋白質表達進行定量，發現D-Gal建模后SIRT1和NRF2蛋白質水平顯著降低，而BJTD顯著增加了它們的表達（圖8B-F）。再次對子宮組織切片進行NRF2和SIRT1的免疫染色，結果顯示，NRF2和SIRT1陽性細胞主要在基質細胞中表達，D-Gal建模后數量明顯減少，而兩種劑量的BJTD均表現出NRF2和SIRT1陽性細胞增加的趨勢（圖8G）。子宮組織中HO-1-陽性細胞主要位于子宮內膜基質，建模后數量明顯減少，但在BJTD-H干預后數量增加（圖8H）。蛋白質定量結果顯示D-Gal干預后子宮組織中SIRT1、NRF2和HO-1表達顯著降低，僅BJTD-H顯著增加這三種蛋白質的表達（圖8I-M）。

圖8

總結：BJTD可以改善D-Gal誘導的子宮衰老中的氧化應激和細胞凋亡水平，其活性成分可以激活SIRT1/NRF2通路發揮其作用。重要的是，研究為傳統中醫影響子宮衰老的分子機制提供了新的見解。傲星生物深耕生信分析十余載，有豐富的實驗方案、完善的下游驗證、機制研究服務，一對一專屬服務為您排憂解難，助您輕松應對畢業和晉升！